lunes, 28 de marzo de 2016

¿Existe el VIH? (V): Diagnóstico por ELISA

Placa de 96 pocillos para ELISA. Fuente:
http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto2/9/biology/index.htm
Bienvenidos de nuevo a este monográfico sobre la existencia del VIH. Nos metemos ya con los tres capítulos que nos van a servir para estudiar los métodos de diagnóstico, dejando claras sus fortalezas y debilidades, para terminar encajando todas las piezas.

Comenzaremos hoy con el ELISA, un método basado en la detección específica de proteínas con anticuerpos frente a las mismas. Como vimos en el capítulo anterior, los anticuerpos se unen de forma altamente específica a sus antígenos, de forma que cada anticuerpo puede unirse únicamente a un antígeno, excepto en caso de reactividad cruzada, como también mencionábamos. Pues el ELISA se aprovecha de esta capacidad de los anticuerpos para detectar proteínas concretas del VIH o bien los anticuerpos que produce el paciente frente a estos antígenos víricos.


ELISA: describiendo la técnica


ELISA es el acrónimo de una técnica que se denomina Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay y que se basa, exactamente igual que el Western blot, en la capacidad que tienen los anticuerpos para reconocer moléculas concretas. 

El ELISA fue descrito en el año 1971 por Perlman y Engval en Suecia y por Schuurs y van Weemen en Holanda, de forma simultánea, independiente y usando técnicas distintas con resultados idénticos. Ambos buscaban una forma de librarse de los radioinmunoensayos (RIA), que utilizaban marcajes radiactivos para cuantificar moléculas de una muestra utilizando radiactividad como señal cuantificable. Así, al unir una enzima al anticuerpo de detección, se podía producir una señal de color que puede cuantificarse en un espectrofotómetro utilizando una recta patrón de concentraciones conocidas de nuestra proteína diana. 

Vamos a describir aquí dos formas de realizar el ELISA: el ELISA de tipo directo, que detecta directamente el antígeno, y el ELISA de tipo sándwich o indirecto, que utiliza dos anticuerpos para detectar dicho antígeno.

ELISA directo

Esquema de ELISA directo
El ELISA directo, como decíamos antes, es el ELISA que se basa en la detección del antígeno que queremos cuantificar. Para ello, se recubren los pocillos de una placa de 96 pocillos como la que tenéis arriba con una solución del antígeno que tenemos que detectar y se hace reaccionar con él un anticuerpo unido a una enzima.

Si no queremos cuantificar la cantidad de antígeno de la muestra basta con pasar el antígeno por el plástico de la placa, que es un plástico especial al que se adsorben las proteínas de nuestra muestra problema. Una vez hecho esto hay que bloquear el plástico para que el anticuerpo, que recordad que también es una proteína, no se pegue a la placa y nos dé una señal inespecífica donde no hay proteína a detectar. Habitualmente, una placa puede bloquearse con una disolución de albúmina sérica bovina (BSA) al 5%. Esto recubrirá la parte del plástico que haya quedado sin cubrir por las proteínas de la muestra. Al no reaccionar con los anticuerpos que utilizaremos para la detección, ninguna molécula de anticuerpo se pegará a la BSA y no tendremos señales inespecíficas. Si queremos cuantificar, antes hay que preparar diluciones de concentraciones conocidas de nuestra proteína a detectar y reservar una de las filas/columnas de la placa de ELISA para construir una recta patrón de la que extrapolaremos la cantidad de proteína en nuestra muestra problema.

Cuando hemos bloqueado la placa, se añade el anticuerpo de detección. Este anticuerpo de detección o anticuerpo primario será el que se pegue a nuestra proteína. Este anticuerpo primario lleva conjugada una enzima que va a actuar como un "chivato" y servirá para "ver" la proteína. Actualmente, los anticuerpos secundarios se conjugan con peroxidasa de rábano que, al ponerla en contacto con agua oxigenada y una molécula cromógena, colorea el pocillo. Como podéis ver en el esquema anterior, los pocillos con una intensidad mayor de color tendrán más color cuanto mayor sea la cantidad de proteína a detectar que haya en esos pocillos. Esta molécula cromogénica a veces no da un color visible, sino que produce quimioluminiscencia y debe leerse en un espectrofluorímetro, pues emite en el rango del ultravioleta.

Esta reacción ya nos va a producir una señal que cualquier espectrofotómetro o espectrofluorímetro podrá leer satisfactoriamente comparándola con una disolución control a la que se llama blanco y que lleva la misma mezcla que lleva cada pocillo excepto por la proteína que nos interesa. Sin embargo, a veces la reacción puede ser demasiado débil, por lo que hay que añadir un anticuerpo de revelado o anticuerpo secundario. ¿Por qué? Pues porque a cada molécula de anticuerpo de detección se unirán varias moléculas de anticuerpo de revelado, con lo que habrá mayor cantidad de enzimas reaccionando y la señal aumentará lo suficiente como para hacerse detectable. En este caso, el anticuerpo de detección no llevará ninguna enzima conjugada, sino que será el anticuerpo de revelado el que la lleve.

Este método de ELISA tiene un problema: el espacio del pocillo es limitado y la cantidad de proteínas en la muestra de un paciente a diagnosticar es muy grande. Así, sólo se pegarán aquellas que estén más presentes y tengan una mayor probabilidad de encontrar un sitio en el plástico. Las que no se peguen se irán al lavar e ir cambiando los reactivos en la placa. Y es posible que nuestra proteína se vaya en estos lavados y eso nos impida detectarla. Para evitar este problema tenemos el ELISA indirecto.

ELISA indirecto o tipo sándwich

Esquema de ELISA indirecto o sándwich
No me canso de repetiros que los anticuerpos no dejan de ser proteínas, simple y llanamente, a pesar de las características tan especiales que tienen. Pero, ¿por qué no aprovechar estas características tan especiales y el hecho de que son proteínas para realizar un test mucho mejor?

Esto se traduce en la aparición del ELISA tipo sándwich. ¿Por qué este nombre tan curioso?

Si miráis el esquema de aquí a la izquierda, lo entenderéis fácilmente. El ELISA de tipo sándwich no recubre el plástico de la placa con la proteína a detectar, sino que se recubre con un primer anticuerpo que se denomina anticuerpo de captura y que reconoce la proteína a determinar. De esta forma, el anticuerpo que tapiza nuestro pocillo captura el antígeno que nos interesa medir y la inmoviliza. Esto nos da una ventaja añadida y es que, al lavar el pocillo, arrastramos toda proteína que no haya sido inmovilizada por el anticuerpo de captura.

Una vez inmovilizada la proteína sobre este primer anticuerpo, es hora de detectarla. Para ello usamos un segundo anticuerpo que actuará como anticuerpo de detección, igual que en el ELISA directo. E igual que en aquel caso, es posible que la señal del anticuerpo de detección no produzca señal suficiente y sea necesario añadir un anticuerpo secundario que aumente la señal a detectar.

Problemas del ELISA: falsos positivos

Volvamos por un momento al artículo sobre los anticuerpos. Si recordáis de allí, hablábamos de la reactividad cruzada, que es ese fenómeno que provoca que anticuerpos específicos frente a un antígeno, con un parátopo que es específico de un epítopo se una a epítopos de antígenos que no están ni siquiera relacionados.

Así, la reactividad cruzada va a provocar que aparezcan lo que se llaman falsos positivos. Se denomina falso positivo al ELISA que da una reacción cromogénica sin que haya presencia bien de los antígenos del virus bien de los anticuerpos frente a dichos antígenos. Como os comentaba en el propio artículo de los anticuerpos, hongos del género Candida han seleccionado proteínas que, imitando a algunos antígenos del VIH, les permite pasar desapercibidos frente al sistema inmunitario. Así, si existen antígenos provenientes de este género de hongos, el ELISA va a detectarlos de forma positiva como si fueran antígenos del VIH.

¿Cómo es esto posible? Vamos a ver si podemos explicarlo de forma fácil. En la práctica clínica es mucho más específico detectar anticuerpos frente a proteínas propias del VIH que frente a antígenos del mismo porque los anticuerpos del paciente ya son específicos frente a esas proteínas. El método elegido para el diagnóstico será el de tipo sándwich, para evitar los problemas que hemos mencionado en el ELISA directo. 

Esquema del ELISA sándwich para detectar anticuerpos del VIH
En el ELISA sándwich para anticuerpos frente al VIH se tapiza la placa con un anticuerpo de captura que unirá antígenos del VIH. El parátopo de estos anticuerpos se unirá a un epítopo concreto y sólo a ese epítopo de alguna proteína del VIH (Parátopo 1 - Epítopo A), como pueda ser gag. Si el paciente es seropositivo y produce anticuerpos frente al VIH, estos anticuerpos se van a unir a gag, pero en un epítopo distinto al que se une el anticuerpo de captura (Parátopo 2 - Epítopo B). Es en este en el que nos vamos a fijar.

Borrelia burgdorferi es el agente productor de la enfermedad de Lyme. Pues bien, B. burgdorferi posee antígenos que son mimotopos (recordad: epítopos que imitan a otros epítopos de otras proteínas) de epítopos del VIH. En concreto, el mimotopo al que me refiero es el tercer dominio variable de la proteína gp120 del VIH (gp120.V3). Este mimotopo aparece en proteínas de superficie de B. burgdorferi, por lo que un ELISA de un paciente que haya estado en contacto con la bacteria o aún tenga la infección, dará color en la placa igual que si contuviera el VIH. Del mismo modo, este tipo de reacciones puede observarse en pacientes de sífilis, puesto que Treponema pallidum comparte mimotopo tanto con VIH como con B. burgdorferi, o con el virus de la gripe, aunque en este último caso el mimotopo será diferente.

Para evitar la confusión se realiza un diagnóstico de confirmación por Western blot, que será lo que ocupe nuestro próximo capítulo.

1 comentario :

  1. Hola como estas te agradezco por este tema y explicarnos de forma en que personas como yo que mo conozco el ttema entendamos algo mo consulta es saber si las pruebas rapidas que existen actualmente son igual de eficaces que el elisa normal gracias

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